近年来，随着国内养禽业规模不断扩大，呼吸道疾病的危害日趋严重，而且混合感染现象频发，临床上难以区分。其中禽传染性支气管炎和H9亚型禽流感仍是危害肉鸡的主要呼吸道疾病。禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是套式病毒目、冠状病毒科、γ冠状病毒属成员，全长大约有27.6 kb，是有囊膜的单股正链RNA病毒，感染宿主后可以引起禽传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB)[1,2]。IB是一种急性、高度接触性的呼吸道疾病，主要侵害宿主的呼吸、消化和泌尿系统[3]。目前发现的基因型有GI～GⅦ7个亚型，亚型又有三十多个分型，目前国内主流基因型有GI-1、GI-7、GI-13、GI-19和GI-22等[4]。
禽流感（Avian Influenza,AI）是由正粘病毒科禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）引起的一种急性、高度接触性传染病[5]，分为高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza Virus,HPAIV）和低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian Influenza Virus,LPAIV）。禽流感病毒根据血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性的差异分型，分为18个HA(H1～H18）亚型和11个NA(N1～N11）亚型[6]。目前流行的主要基因型有H9N2(LPAIV)、H7N9和H5N6(HPAIV),Liu等[7]对H9N2亚型创建了一种新型谱系划分的方法，更有利于统计该基因型的流行情况。
2023年山东某鸡场部分肉鸡发生不同程度的呼吸困难，并伴有零星死亡，死亡鸡剖检可见气管出血、支气管栓塞、部分鸡有尿酸盐沉积。为探明其发病原因，实验室对采集的病料优先进行PCR快速诊断，然后进行病毒分离鉴定，进一步探索分离毒株主要基因的遗传变异情况，为当地采取有效的防控措施提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 毒株来源与发病情况
2023年6月，山东某养鸡场饲养的20日龄肉鸡陆续出现气管啰音、咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状，且陆续出现死亡，发病原因尚不清楚。
1.2 剖解变化
解剖病死鸡，可见支气管栓塞，部分鸡肾脏有尿酸盐沉积。
2 实验室诊断
2.1 SPF鸡胚与试剂
SPF鸡胚购于山东昊泰实验动物繁育有限公司；IBV、H9亚型AIV阳性血清由山东省农业科学院家禽研究所保存；Axy Prep体液病毒DNA/RNA试剂盒购于杭州AXYGEN公司；Onestep RT-PCR试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；DL 2000 DNA Marker购自北京康润诚业生物科技有限公司；p MD18-T Vector Cloning Kit购自大连宝生物有限公司；Biospin胶回收和PCR产物纯化试剂盒购自Bio Flux公司。
2.2 病料处理及PCR检测
取采集的气管、支气管、肾脏等病料加入5倍其体积的生理盐水进行研磨，反复冻融3次后取出，8 000 r/min离心5 min，提取核酸，备用。使用IBV、H9亚型AIV、传染性喉气管炎（ILTV）和鸡毒支原体（MG）等检测引物对其进行PCR鉴定，根据检测结果进行下一步试验。
2.3 病毒分离与纯化
将病料以9 000 r/min离心30 min取上清液，加5 000 U青链霉素充分作用，分别加入IBV和H9亚型AIV的阳性血清中和，作用30 min后分别将病毒液接种9日龄SPF鸡胚，每组接种10个SPF鸡胚；设阴性对照组，放入37℃培养箱培养，每12 h照胚一次，弃去24 h内死亡鸡胚。H9亚型AIV阳性血清中和组，48 h收获1/2鸡胚的尿囊液，进行PCR检测；IBV阳性血清中和组，96 h收获1/2鸡胚的尿囊液，进行HA试验；同时用H9阳性血清中和后进行HA试验。剩余的鸡胚培养至168 h，观察鸡胚变化。
2.4 分离株基因扩增及序列分析
利用实验室设计的引物分别扩增分离病毒的S1基因和HA基因全长，RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将含有目的条带的纯化产物送至青岛擎科生物有限公司测序。采用DNASTAR软件与Gen Bank中下载的参考株的IBV S1或H9亚型AIV HA基因序列进行比较分析。MEGA5.0软件绘制进化树，在线生物软件Net NGlyc 1.0Server进行N-糖基化位点分析[8]，进一步分析IBV或H9亚型AIV分离毒株的遗传变异情况。
3 结果
3.1 PCR鉴定结果
将提取的RNA模板用AIV通用、H9亚型-AIV、IBV、NDV（新城疫病毒）、MG、IBDV（传染性法氏囊病毒）和ITLV等检测引物进行检测，检测结果显示AIV通用、H9亚型-AIV及IBV扩增出目的片段，分别为230、250 bp和470 bp，与预期片段大小一致（图1），其他引物未见特异性条带，说明该病料中可能存在着IBV和H9亚型AIV的混合感染。
3.2 病毒分离与鸡胚接种
病料样品分别接种SPF鸡胚后，未出现鸡胚死亡，其中H9亚型AIV阳性血清中和组收获尿囊液PCR检测为IBV阳性，命名为SDDZ/202301（简称DZ01）。继续培养至168 h的鸡胚发育矮小，且身体蜷缩为团状，为IBV典型的侏儒胚；而IBV阳性血清中和组的鸡胚正常，无明显病变。
3.3 血凝试验
将收获的尿囊液进行HA试验，H9亚型AIV阳性血清中和组收获的尿囊液无HA效价，其血凝特性能被H9亚型AIV阳性血清中和掉；而IBV阳性血清中和组尿囊液对1%红细胞的血凝效价为7 log2，其血凝特性能被H9亚型AIV阳性血清中和掉，进一步表明该分离毒为H9亚型AIV，命名为SDDZ/202302(DZ02）。
3.4 分离株进化树和同源性分析
以分离毒RNA为模板，分别用AIV-H9 HA F/R和IBV-S1 F/R两对引物进行RT-PCR扩增，扩增片段大小分别约为1 676 bp和1 629 bp（图2）。回收目的片段克隆至p MD18-T载体，送青岛擎科生物有限公司测序。
DZ01 S1基因核苷酸（氨基酸）同源性分析结果显示，DZ01与所有参考株的核苷酸和氨基酸同源性分别是60.2%～96.7%和50.3%～95.6%,其中与GI-19(LX4）同源性最高，分别为96.7%和95.6%；蛋白裂解位点为HRRRR，与GI-19型参考株一致。与疫苗株GI-1、GI-13和GI-22的核苷酸（氨基酸）同源性分别为77.2%(76.8%),78.3%(78.9%）和80.4%(78.3%）。基于S1基因构建的进化树（图3），显示DZ01分离株与GI-19(LX4）属于同一分支，亲缘关系最近，说明DZ01未发生明显变异，仍属于当前流行的优势IBV。
DZ02与所有AIV-H9参考株的核苷酸和氨基酸同源性为78.1%～95.1%和79.4%～94.2%，而与2017、2018、2019年和2022年毒株核苷酸（氨基酸）同源性分别为91.3%～93%(92.1%～94.1%）、91.1%～92.9%(91.8%～94.2%）、89.6%～92.7%(92.3%～94.1%）和93.1%～95.1%(92.2%～93.4%）。基于HA基因构建的进化树（图4），显示DZ02与实验室2017～2022年的大部分分离株亲缘关系较近，均属于H9.4.2.5分支，说明该地区分离株仍为主流基因型H9.4.2.5基因型。
3.5 分离株N-糖基化位点分析
DZ01与GI-19型参考株进行氨基酸对比分析后，发现有13个位点的氨基酸发生突变，分别是23(S）、65(G）、86(S）、140(F）、156～157(SR）、226(K）、275(A）、342(D）、422(T）、436(N）、486(P）、511(I），其中38～67位氨基酸突变位于S1基因高变区Ⅰ（HVRⅠ），91～141位氨基酸突变点位于HVRⅡ，第274～387氨基酸突变位点则位于HVRⅢ。糖基化位点分析结果显示DZ02具有15个N-糖基化位点，与参考株GI-19(LX4）相比较在141位点（NGS）缺乏一个N-糖基化位点，其余位点均一致。DZ02糖基化位点分析结果显示有8个N-糖基化位点，较参考株H9.4.2.5在495(NGS）位置少一个N-糖基化位点，其余位点相同。
4 讨论
近年来，因肉鸡规模化程度高、养殖密度大，呼吸道疾病呈高发趋势。因呼吸道疾病导致鸡群抵抗力下降后感染多种传染病的情况也比较常见，混合感染使得鸡群的病死率骤升，给养禽业带来巨大的经济损失[9]。张建军等[10]曾报道IBV和AIV混合感染后导致呼吸道出现炎性渗出物并堵塞支气管。我们报道的病例也出现了支气管的栓塞，结合实验室PCR诊断、病原分离鉴定及测序分析，明确该病例为IBV(GI-19型）和AIV-H9(H9.4.2.5分支)混合感染。
进一步分析发现，IBV分离株DZ01尽管与GI-19型亲缘距离最近，属于同一基因型，但其S1基因发生了13个氨基酸的突变，其中高变区Ⅰ（HVRⅠ）有1个突变，HVRⅡ有1个突变，HVRⅢ有2个突变。这些氨基酸位点的突变是否与其致病性的改变有关值得去关注。此外，Zheng等[11]研究发现IBV在不同位置的N-糖基化位点可能对S蛋白介导的融合、病毒感染性和复制性产生不同的影响。高绪慧等[12]在对山东地区流行的17株H9N2毒株基因组遗传进化分析时，曾推测潜在的糖基化位点可能会影响致病性。而在本研究中，DZ01株较GI-19型参考株在141位点（NGS）少一个位点，DZ02较H9.4.2.5参考株在495(NGS）位置少一个N-糖基化位点，分离毒株的基化位点改变是否对病毒致病性和抗原性有影响需要进一步探索。
传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒均属于条件性病原，一旦出现环境应激、饲养条件改变等影响，鸡群感染这两种病的概率就会大大增加。因此，养殖场管理者要不断提升饲养管理水平，加强生物安全意识，如有发病迹象，及时进行实验室确诊，迅速采取措施，降低经济损失。
疫苗接种仍是预防鸡传染性支气管炎和H9亚型禽流感的重要措施，因此，养殖企业要密切关注当地毒株的流行现状，有针对性地调整免疫程序，加强抗体的监测，掌握鸡群的免疫效果，做到科学防控。
